Rudolf II. (1552–1612) zählt zu den prägendsten Herrschern der Prager Geschichte. Als Kaiser des Heiligen Römischen Reiches und König von Böhmen machte er Prag um 1600 zu einem der wichtigsten politischen, wissenschaftlichen und kulturellen Zentren Europas.
Rudolf II. verlegte seine Residenz dauerhaft von Wien nach Prag und etablierte die Stadt als kaiserliche Metropole. Sein Hof zog Gelehrte, Künstler und Alchemisten aus ganz Europa an. Unter seiner Förderung arbeiteten hier Persönlichkeiten wie Tycho Brahe und Johannes Kepler, deren Forschungen die moderne Astronomie entscheidend voranbrachten. Gleichzeitig sammelte Rudolf mit großer Leidenschaft Kunstwerke, wissenschaftliche Instrumente und exotische Objekte. Diese Sammlungen galten als legendär und machten die Prager Burg zu einem Zentrum des Manierismus nördlich der Alpen.
Politisch war Rudolfs Regentschaft jedoch von inneren Spannungen geprägt. Seine zunehmende Zurückgezogenheit, gesundheitliche Probleme und Konflikte mit seinem Bruder Matthias schwächten seine Machtposition. Dennoch hatte seine Herrschaft langfristige Auswirkungen auf Böhmen: Die von ihm erlassene Majestätsurkunde von 1609, die Religionsfreiheit garantierte, spielte eine wichtige Rolle in den Entwicklungen, die wenige Jahre später zum Dreißigjährigen Krieg führten.